LABORATORIUM KIMIA FARMASI
TEKNOLOGI LABORATORIUM KESEHATAN
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN
PEMERIKSAAN FUNGSI HATI BILIRUBIN TOTAL DAN DIRECT
OLEH
NAMA : YAYOK ZAIREN
MAKASSAR
2011
BAB I
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Banyak faal metabolik yang dilakukan oleh jaringan hati, maka ada banyak pula, lebih dari 100, jenis test yang mengukur reaksi faal hati.' Semuanya, disebut sebagai "tes faal hati “Sebenarnya hanya beberapa yang- benar-benar mengukur faal hati.1-3 Diantara berbagai tes tersebut tidak ada tes tunggal yang efektif mengukur faal hati secara keseluruhan. Beberapa tes terlalu peka sehingga tidak khas, sebagian lagi dipengaruhi pula oleh faktor - faktor di luar hati, sebagian lagi sudah obsolete.
Beberapa kriteria yang dapat dipakai adalah, antara lain, dapatnya dikerjakan tes tersebut secara baik dengan sarana yang memadai, segi kepraktisan, biaya, stress yang dibebankan kepada penderita, kemampuan diagnostik dari tes tersebut, dan lain-lain. Pada pengujian kerusakan hati, gangguan biokimia yang terlihat adalah peningkatan permeabilitas dinding sel, berkurangnya kapasitas sintesa, terganggunya faal ekskresi, berkurangnya kapasitas penyimpanan, terganggunya faal detoksifikasi peningkatan reaksi mesenkimal dan imunologi yang abnormal. Pada praktikum kali ini, dilakukan tes kimiawi meliputi pemeriksaan bilirubin total dan direk yang dapat menunjang suatu diagnosa terhadap adanya kelainan fungsi hati.
I.2 Maksud dan tujuan Percobaan
I.2.1 Maksud percobaan
Untuk memahami dan mempelajari cara pemeriksaan bilirubin total dan bilirubin direk.
I.2.2 Tujuan percobaan
Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mengetahui dan mengidentifikasi kelainan pada fungsi hati dengan melihat kadar bilirubin total dan bilirubin direk.
I.3 Prinsip Percobaan
a. Bilirubin total
Mengidentifikasi adanya kelainan fungsi hati dengan pemeriksaan bilirubin total dengan penambahan reagen bilirubin total dimana asam sulphanilic direaksiakan dengan natrium nitrit menjadi diazotised sulphanilic acid (DSA) yang akan bereaksi dengan bilirubin dan accelator membentuk zat warna azo.
Bilirubin direct
Mengidentifikasi adanya kelainan fungsi hati dengan pemeriksaan bilirubin direct dengan penambahan reagen bilirubin direct dimana asam sulphanilic direaksiakan dengan natrium nitrit menjadi diazotised sulphanilic acid (DSA) yang akan berikatan dengan bilirubin dan membentuk direct azobilirubin.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II.1 Teori Umum
Hati merupakan organ yang sangat penting dalam pengaturan homeostasis tubuh yang meliputi metabolisme, biotransformasi, sintesis, penyimpanan dan imunologi. Dari sudut pandang anatomi dan fisiologi, hati adalah organ terbesar dari sistem intestinal dengan berat antara 1,2-1,8 kg atau kurang lebih 25% berat badan orang dewasa yang menempati sebagian besar kuadran kanan atas abdomen dan merupakan pusat metabolisme tubuh dengan fungsi yang sangat kompleks. Batas atas hati berada sejajar dengan ruang interkostal V kanan dan batas bawah menyerong ke atas dari iga IX kanan ke iga IX kiri. (1; 3)
Permukaan posterior hati berbentuk cekung dan terdapat celah transversal sepanjang 5 cm dari sistem porta hepatis. Omentum minor terdapat mulai dari sistem porta yang mengandung arteri hepatica, vena porta dan duktus koledokus. Sistem porta terletak di depan vena kava dan dibalik kandung empedu. Permukaan anterior yang cembung dibagi menjadi 2 lobus oleh adanya perlekatan ligamentum falsiform yaitu lobus kiri dan lobus kanan yang berukuran kira-kira 2 kali lobus kiri. Pada daerah antara ligamentum falsiform dengan kandung empedu di lobus kanan kadang-kadang dapat ditemukan lobus kuadratus dan sebuah daerah yang disebut sebagai lobus kaudatus yang biasanya tertutup oleh vena kava inferior dan ligamentum venosum pada permukaan posterior. Hati terbagi dalam 8 segmen dengan fungsi yang berbeda. Pada dasarnya, garis Cantlie yang terdapat mulai dari vena kava sampai kandung empedu telah membagi hati menjadi 2 lobus fungsional, dan dengan adanya daerah dengan vaskularisasi relatif sedikit, kadang-kadang dijadikan batas reseksi. (1; 3)
Gambar 1. Anatomi hati
Hepar dibungkus oleh simpai yg tebal, terdiri dari serabut kolagen dan jaringan elastis yg disebut Kapsul Glisson. Simpai ini akan masuk ke dalam parenchym hepar mengikuti pembuluh darah getah bening dan duktus biliaris. Massa dari hepar seperti spons yg terdiri dari sel-sel yg disusun di dalam lempengan-lempengan/ plate dimana akan masuk ke dalamnya sistem pembuluh kapiler yang disebut sinusoid. Sinusoid-sinusoid tersebut berbeda dengan kapiler-kapiler di bagian tubuh yang lain, oleh karena lapisan endotel yang meliputinya terediri dari sel-sel fagosit yg disebut sel kupfer. Sel kupfer lebih permeabel yang artinya mudah dilalui oleh sel-sel makro dibandingkan kapiler-kapiler yang lain .Lempengan sel-sel hepar tersebut tebalnya 1 sel dan punya hubungan erat dengan sinusoid. Pada pemantauan selanjutnya nampak parenkim tersusun dalam lobuli-lobuli Di tengah-tengah lobuli tdp 1 vena sentralis yg merupakan cabang dari vena-vena hepatika (vena yang menyalurkan darah keluar dari hepar).(1 ; 4)
bagian tepi di antara lobuli-lobuli terhadap tumpukan jaringan ikat yang disebut traktus portalis/ TRIAD yaitu traktus portalis yang mengandung cabang-cabang v.porta, A.hepatika, ductus biliaris.Cabang dari vena porta dan A.hepatika akan mengeluarkan isinya langsung ke dalam sinusoid setelah banyak percabangan Sistem bilier dimulai dari canaliculi biliaris yang halus yg terletak di antara sel-sel hepar dan bahkan turut membentuk dinding sel. Canaliculi akan mengeluarkan isinya ke dalam intralobularis, dibawa ke dalam empedu yg lebih besar , air keluar dari saluran empedu menuju kandung empedu.(1;4)
gambar 2. Kupfer sel
Hati merupakan pusat dari metabolisme seluruh tubuh, merupakan sumber energi tubuh sebanyak 20% serta menggunakan 20 – 25% oksigen darah.Ada beberapa fungsi hati yaitu :
1. Fungsi hati sebagai metabolisme karbohidrat
Pembentukan, perubahan dan pemecahan KH, lemak dan protein saling berkaitan 1 sama lain. Hati mengubah pentosa dan heksosa yang diserap dari usus halus menjadi glikogen, mekanisme ini disebut glikogenesis. Glikogen lalu ditimbun di dalam hati kemudian hati akan memecahkan glikogen menjadi glukosa. Proses pemecahan glikogen mjd glukosa disebut glikogenelisis.Karena proses-proses ini, hati merupakan sumber utama glukosa dalam tubuh, selanjutnya hati mengubah glukosa melalui heksosa monophosphat shunt dan terbentuklah pentosa. Pembentukan pentosa mempunyai beberapa tujuan: Menghasilkan energi, biosintesis dari nukleotida, nucleic acid dan ATP, dan membentuk/ biosintesis senyawa 3 karbon (3C)yaitu piruvic acid (asam piruvat diperlukan dalam siklus krebs).(1 : 5)
2. Fungsi hati sebagai metabolisme lemak
Hati tidak hanya membentuk/ mensintesis lemak tapi sekaligus mengadakan katabolisis asam lemak. Asam lemak dipecah menjadi beberapa komponen :
1.Senyawa 4 karbon – KETON BODIES
2. Senyawa 2 karbon – ACTIVE ACETATE (dipecah menjadi asam lemak dan gliserol)
3. Pembentukan cholesterol
3. Pembentukan cholesterol
4. Pembentukan dan pemecahan fosfolipid
Hati merupakan pembentukan utama, sintesis, esterifikasi dan ekskresi kholesterol. Dimana serum Cholesterol menjadi standar pemeriksaan metabolisme lipid (1 : 5)
Gambar 3.fungsi hati dalam metabolism lemak
3. Fungsi hati sebagai metabolisme protein
Hati mensintesis banyak macam protein dari asam amino. dengan proses deaminasi, hati juga mensintesis gula dari asam lemak dan asam amino.Dengan proses transaminasi, hati memproduksi asam amino dari bahan-bahan non nitrogen. Hati merupakan satu-satunya organ yg membentuk plasma albumin dan ∂ - globulin dan organ utama bagi produksi urea.Urea merupakan end product metabolisme protein.∂ - globulin selain dibentuk di dalam hati, juga dibentuk di limpa dan sumsum tulang β – globulin hanya dibentuk di dalam hati.albumin mengandung ± 584 asam amino dengan BM 66.000 (1 : 5)
4. Fungsi hati sehubungan dengan pembekuan darah
Hati merupakan organ penting bagi sintesis protein-protein yang berkaitan dengan koagulasi darah, misalnya: membentuk fibrinogen, protrombin, faktor V, VII, IX, X. Benda asing menusuk kena pembuluh darah – yang beraksi adalah faktor ekstrinsi, bila ada hubungan dengan katup jantung – yang beraksi adalah faktor intrinsik.Fibrin harus isomer biar kuat pembekuannya dan ditambah dengan faktor XIII, sedangakan Vit K dibutuhkan untuk pembentukan protrombin dan beberapa faktor koagulasi
5. Fungsi hati sebagai metabolisme vitamin
Semua vitamin disimpan di dalam hati khususnya vitamin A, D, E, K
6. Fungsi hati sebagai detoksikasi
6. Fungsi hati sebagai detoksikasi
Hati adalah pusat detoksikasi tubuh, Proses detoksikasi terjadi pada proses oksidasi, reduksi, metilasi, esterifikasi dan konjugasi terhadap berbagai macam bahan seperti zat racun, obat over dosis.
7. Fungsi hati sebagai fagositosis dan imunitas
Sel kupfer merupakan saringan penting bakteri, pigmen dan berbagai bahan melalui proses fagositosis. Selain itu sel kupfer juga ikut memproduksi ∂ - globulin sebagai imun livers mechanism. (1 : 5)
8. Fungsi hemodinamik
Hati menerima ± 25% dari cardiac output, aliran darah hati yang normal ± 1500 cc/ menit atau 1000 – 1800 cc/ menit. Darah yang mengalir di dalam a.hepatica ± 25% dan di dalam v.porta 75% dari seluruh aliran darah ke hati. Aliran darah ke hepar dipengaruhi oleh faktor mekanis, pengaruh persarafan dan hormonal, aliran ini berubah cepat pada waktu exercise, terik matahari, shock.Hepar merupakan organ penting untuk mempertahankan aliran darah (1: 6)
Gambar 4. Fungsi hati hemodinamik
Faal Hati merupakan pusat berbagai proses metabolisme, hal ini dimungkinkan sebab hati menerima darah baik dari sirkulasi system dan juga dari system porta.(6 : 19)
Jaringan hati tersusun dari sel parenkim (60%), sel system fagosotik monosit-makrofag (lebih dikenal sebagai Reticulo-Endothelial Sytem, RES) yaitu sel-sel kupffer (30%), dan sisanya adalah jaringan vaskuler, saluran empedu dan jaringan penunjang. Sel-sel hati berderet radialis dipisahkan oleh sinusoid dengan sel-sel kupfer pada dindingnya.( 4 : 9)
B. Katabolisme Heme
Katabolisme heme dari semua hemeprotein terjadi dalam fraksi mikrosom sel retikuloendotel oleh sistem enzym yang kompleks yaitu heme oksigenase yang merupakan enzym dari keluarga besar sitokrom P450. Langkah awal pemecahan gugus heme ialah pemutusan jembatan α metena membentuk biliverdin, suatu tetrapirol linier. (2:140)
Besi mengalami beberapa kali reaksi reduksi dan oksidasi, reaksi-reaksi ini memerlukan oksigen dan NADPH. Pada akhir reaksi dibebaskan Fe3+ yang dapat digunakan kembali, karbon monoksida yang berasal dari atom karbon jembatan metena dan biliverdin. Biliverdin, suatu pigmen berwarna hijau akan direduksi oleh biliverdin reduktase yang menggunakan NADPH sehingga rantai metenil menjadi rantai metilen antara cincin pirol III – IV dan membentuk pigmen berwarna kuning yaitu bilirubin. Perubahan warna pada memar merupakan petunjuk reaksi degradasi ini. (2:141)
Gambar 5 katabolisme hem
Dalam setiap 1 gr hemoglobin yang lisis akan membentuk 35 mg bilirubin. Pada orang dewasa dibentuk sekitar 250–350 mg bilirubin per hari, yang dapat berasal dari pemecahan hemoglobin, proses erytropoetik yang tidak efekif dan pemecahan hemprotein lainnya. (2:141)
Bilirubin dari jaringan retikuloendotel adalah bentuk yang sedikit larut dalam plasma dan air. Bilirubin ini akan diikat nonkovalen dan diangkut oleh albumin ke hepar. Dalam 100 ml plasma hanya lebih kurang 25 mg bilirubin yang dapat diikat kuat pada albumin. Bilirubin yang melebihi jumlah ini hanya terikat longgar hingga mudah lepas dan berdiffusi ke jaringan.(2:141)
Bilirubin I (indirek) bersifat lebih sukar larut dalam air dibandingkan dengan biliverdin. Pada reptil, amfibi dan unggas hasil akhir metabolisme heme ialah biliverdin dan bukan bilirubin seperti pada mamalia. Keuntungannya adalah ternyata bilirubin merupakan suatu anti oksidan yang sangat efektif, sedangkan biliverdin tidak. Efektivitas bilirubin yang terikat pada albumin kira-kira 1/10 kali dibandingkan asam askorbat dalam perlindungan terhadap peroksida yang larut dalam air. Lebih bermakna lagi, bilirubin merupakan anti oksidan yang kuat dalam membran, bersaing dengan vitamin E.(2:213)
Di hati, bilirubin I (indirek) yang terikat pada albumin diambil pada permukaan sinusoid hepatosit oleh suatu protein pembawa yaitu ligandin. Sistem transport difasilitasi ini mempunyai kapasitas yang sangat besar tetapi penggambilan bilirubin akan tergantung pada kelancaran proses yang akan dilewati bilirubin berikutnyaBilirubin nonpolar (I/indirek) akan menetap dalam sel jika tidak diubah menjadi bentuk larut (II/direk). Hepatosit akan mengubah bilirubin menjadi bentuk larut (II/direk) yang dapat diekskresikan dengan mudah ke dalam kandung empedu. .(2:213)
Proses perubahan tersebut melibatkan asam glukoronat yang dikonjugasikan dengan bilirubin, dikatalisis oleh enzym bilirubin glukoronosiltransferase. Hati mengandung sedikitnya dua isoform enzym glukoronosiltransferase yang terdapat terutama pada retikulum endoplasma. Reaksi konjugasi ini berlangsung dua tahap, memerlukan UDP asam glukoronat sebagai donor glukoronat. Tahap pertama akan membentuk bilirubin monoglukoronida sebagai senyawa antara yang kemudian dikonversi menjadi bilirubin diglukoronida yang larut pada tahap kedua. (2:213)
Gambar 6. Pembentukkan bilirubin
Eksresi bilirubin larut ke dalam saluran dan kandung empedu berlangsung dengan mekanisme transport aktif yang melawan gradien konsentrasi. Dalam keadaan fisiologis, seluruh bilirubin yang diekskresikan ke kandung empedu berada dalam bentuk terkonjugasi (bilirubin II).(2:214)
C. Bilirubin
Bilirubin adalah pigmen kuning yang berasal dari perombakan heme dari hemoglobin dalam proses pemecahan eritrosit oleh sel retikuloendotel. Di samping itu sekitar 20% bilirubin berasal dari perombakan zat-zat lain. Sel retikuloendotel membuat bilirubin tidak larut dalam air, bilirubin yang disekresikan dalam darah harus diikatkan albumin untuk diangkut dalam plasma menuju hati.(3:295)
Di dalam hati, hepatosit melepaskan ikatan dan mengkonjugasinya dengan asam glukoronat sehingga bersifat larut air, sehingga disebut bilirubin direk atau glukoroniltransferase, selain dalam bentuk diglukoronida dapat juga dalam bentuk bilirubin terkonjugasi. Proses konjugasi melibatkan enzim glukoroniltransferase, selain dalam bentuk diglukoronida dapat juga dalam bentuk monoglukoronida atau ikatan dengan glukosa, xylosa dan sulfat. terkonjugasi dikeluarkan melalui proses energi kedalam sistem bilier. (3:295)
Bilirubin berikatan dengan albumin sehingga zat ini dapat diangkut ke seluruh tubuh. Dalam bentuk ini, spesies molekular disebut bilirubin tak terkonjujgasi. Sewaktu zat ini beredar melalui hati, hepatosit melakukan fungsi sebagai berikut :
1. Penyerapan bilirubin dan sirkulasi
2. Konjugasi enzimatik sebagai bilirubin glukuronida
3. Pengangkutan dan ekskresi bilirubin terkonjugasi ke dalam empedu untuk dikeluarkan dari tubuh
Konjugasi intrasel asam glukoronat ke dua tempat di molekul bilirubin menyebabkan bilirubin bermuatan negatif, sehingga bilirubin terkonjugasi ini larut dalam fase air. Apabila terjadi obstruksi atau kegagalan lain untuk mengekskresikan bilirubin terkonjugasi ini zat ini akan masuk kembali ke dan tertimbun dalam sirkulasi (3:295)
Selain bilirubin masuk ke dalam usus, bakteri kolon mengubah bilirubin menjadi urobilinogen yaitu beberapa senyawa tidak berwarna yang kemudian mengalami oksidasi menjadi pigmen coklat urobilin. Urobilin diekskresikan dalam feses tetapi sebagian urobilinogen direabsorpsi melalui usus, dan melalui sirkulasi portal diserap oleh hati dan direekskresikan dalam empedu. Karena larut air, urobilinogen juga dapat keluar melalui urin apabila mencapai ginjal.(3:295)
Pembentukan bilirubin
Dalam keadaan fisiologis, masa hidup eritrosit manusia sekitar 120 hari, eritrosit mengalami lisis 1-2×108 setiap jamnya pada seorang dewasa dengan berat badan 70 kg, dimana diperhitungkan hemoglobin yang turut lisis sekitar 6 gr per hari. Sel-sel eritrosit tua dikeluarkan dari sirkulasi dan dihancurkan oleh limpa. Apoprotein dari hemoglobin dihidrolisis menjadi komponen asam-asam aminonya. Katabolisme heme dari semua hemeprotein terjadi dalam fraksi mikrosom sel retikuloendotel oleh sistem enzim yang kompleks yaitu heme oksigenase yang merupakan enzim dari keluarga besar sitokrom P450. Langkah awal pemecahan gugus heme ialah pemutusan jembatan α metena membentuk biliverdin, suatu tetrapirol linier. Besi mengalami beberapa kali reaksi reduksi dan oksidasi, reaksi-reaksi ini memerlukan oksigen dan NADPH. Pada akhir reaksi dibebaskan Fe3+ yang dapat digunakan kembali, karbon monoksida yang berasal dari atom karbon jembatan metena dan biliverdin. Biliverdin, suatu pigmen berwarna hijau akan direduksi oleh biliverdin reduktase yang menggunakan NADPH sehingga rantai metenil menjadi rantai metilen antara cincin pirol III – IV dan membentuk pigmen berwarna kuning yaitu bilirubin. Perubahan warna pada memar merupakan petunjuk reaksi degradasi ini. (4:2)
Bilirubin bersifat lebih sukar larut dalam air dibandingkan dengan biliverdin. Dalam setiap 1 gr hemoglobin yang lisis akan membentuk 35 mg bilirubin dan tiap hari dibentuk sekitar 250–350 mg pada seorang dewasa, berasal dari pemecahan hemoglobin, proses erytropoetik yang tidak efekif dan pemecahan hemprotein lainnya. Bilirubin dari jaringan retikuloendotel adalah bentuk yang sedikit larut dalam plasma dan air. Bilirubin ini akan diikat nonkovalen dan diangkut oleh albumin ke hepar. Dalam 100 ml plasma hanya lebih kurang 25 mg bilirubin yang dapat diikat kuat pada albumin. Bilirubin yang melebihi jumlah ini hanya terikat longgar hingga mudah lepas dan berdifusi ke jaringan. Bilirubin yang sampai dihati akan dilepas dari albumin dan diambil pada permukaan sinusoid hepatosit oleh suatu protein pembawa yaitu ligandin. Sistem transport difasilitasi ini mempunyai kapasitas yang sangat besar tetapi penggambilan bilirubin akan tergantung pada kelancaran proses yang akan dilewati bilirubin berikutnya. Bilirubin nonpolar akan menetap dalam sel jika tidak diubah menjadi bentuk larut. Hepatosit akan mengubah bilirubin menjadi bentuk larut yang dapat diekskresikan dengan mudah kedalam kandung empedu. Proses perubahan tersebut melibatkan asam glukoronat yang dikonjugasikan dengan bilirubin, dikatalisis oleh enzim bilirubin glukoronosiltransferase. Hati mengandung sedikitnya dua isoform enzym glukoronosiltransferase yang terdapat terutama pada retikulum endoplasma. Reaksi konjugasi ini berlangsung dua tahap, memerlukan UDP asam glukoronat sebagai donor glukoronat. Tahap pertama akan membentuk bilirubin monoglukoronida sebagai senyawa antara yang kemudian dikonversi menjadi bilirubin diglukoronida yang larut pada tahap kedua.
Metabolisme Bilirubin
Hati merupakan organ terbesar, terletak di kuadran kanan atas rongga abdomen. Hati melakukan banyak fungsi penting dan berbeda-beda dan trgantung pada sistem darahnya yang unik dan sel-selnya yang sangat khusus. Hati tertutupi kapsul fibroelastik berupa kapsul glisson. Kapsul glisson berisi pembuluh darah, pembuluh limfe, dan saraf. Hati terbagi menjadi lobus kanan dan lobus kiri. Tiap lobus tersusun atas unit-unit kecil yang disebut lobulus. Lobulus terdiri sel-sel hati, disebut hepatosit yang menyatu dalam lempeng. Hepatosit dan jaringan hati mudah mengalami regenerasi. (3:216)
Hati menerima darah dari 2 sumber, yaitu arteri hepatika (banyak mengandung oksigen) yang mengalirkan darah ±500 ml/mnt dan vena porta (kurang kandungan oksigen tapi kaya zat gizi, dan mungkin berisi zat toksik dan bakteri) yang menerima darah dari lambung, usus, pankreas dan limpa; mengalirkan darah ±1000 ml/mnt. Kedua sumber tersebut mengalir ke kapiler hati yang disebut sinusoid lalu diteruskan ke vena sentralis ditiap lobulus. Dan dari semua lobulus ke vena hepatika berlanjut ke vena kava inferior. Tekanan darah di sistem porta hepatika sangat rendah, ±3 mmHg dan di vena kava hampir 0 mmHg. Karena tidak ada resistensi aliran melalui vena porta dan vena kava sehingga darah mudah masuk dan keluar hati. Hati menjalankan berbagai macam fungsi terutama metabolisme, baik anabolisme atau katabolisme molekul-molekul makanan dasar (gula, asam lemak, asam amino) dilakukan oleh sel-sel hati. (3:216)
Bilirubin merupakan suatu senyawa tetrapirol yang dapat larut dalam lemak maupun air yang berasal dari pemecahan enzimatik gugus heme dari berbagai heme protein seluruh tubuh. Sebagian besar ( kira- kira 80 % ) terbentuk dari proses katabolik hemoglobin, dalam proses penghancuran eritrosit oleh RES di limpa, dan sumsum tulang. Disamping itu sekitar 20 % dari bilirubin berasal dari sumber lain yaitu non heme porfirin, prekusor pirol dan lisis eritrosit muda. Dalam keadaan fisiologis pada manusia dewasa, eritrosit dihancurkan setiap jam. Dengan demikian bila hemoglobin dihancurkan dalam tubuh, bagian protein globin dapat dipakai kembali baik sebagai protein globin maupun dalam bentuk asam- asam aminonya.(3:216-217)
Metabolisme bilirubin diawali dengan reaksi proses pemecahan heme oleh enzim hemoksigenase yang mengubah biliverdin menjadi bilirubin oleh enzim bilirubin reduksitase. Sel retikuloendotel membuat bilirubin tak larut air, bilirubin yang sekresikan ke dalam darah diikat albumin untuk diangkut dalam plasma. Hepatosit adalah sel yang dapat melepaskan ikatan, dan mengkonjugasikannya dengan asam glukoronat menjadi bersifat larut dalam air. Bilirubin yang larut dalam air masuk ke dalam saluran empedu dan diekskresikan ke dalam usus . Didalam usus oleh flora usus bilirubin diubah menjadi urobilinogen yang tak berwarna dan larut air, urobilinogen mudah dioksidasi menjadi urobilirubin yang berwarna. Sebagian terbesar dari urobilinogen keluar tubuh bersama tinja, tetapi sebagian kecil diserap kembali oleh darah vena porta dikembalikan ke hati. Urobilinogen yang demikian mengalami daur ulang, keluar lagi melalui empedu. Ada sebagian kecil yang masuk dalam sirkulasi sistemik, kemudian urobilinogen masuk ke ginjal dan diekskresi bersama urin (3:217)
Metabolisme Bilirubin di Hati
Metabolisme bilirubin dalam hati dibagi menjadi 3 proses:
1. Pengambilan (uptake) bilirubin oleh sel hati
2. Konjugasi bilirubin
3. Sekresi bilirubin ke dalam empedu (5:2)
Macam dan sifat bilirubin
a. Bilirubin terkonjugasi /direk
Bilirubin terkonjugasi /direk adalah bilirubin bebas yang bersifat larut dalam air sehingga dalam pemeriksaan mudah bereaksi. Bilirubin terkonjugasi (bilirubin glukoronida atau hepatobilirubin ) masuk ke saluran empedu dan diekskresikan ke usus. Selanjutnya flora usus akan mengubahnya menjadi urobilinogen.(6:1)
Bilirubin terkonjugasi bereaksi cepat dengan asam sulfanilat yang terdiazotasi membentuk azobilirubin. Peningkatan kadar bilirubin direk atau bilirubin terkonjugasi dapat disebabkan oleh gangguan ekskresi bilirubin intrahepatik antara lain Sindroma Dubin Johson dan Rotor, Recurrent (benign) intrahepatic cholestasis, Nekrosis hepatoseluler, Obstruksi saluran empedu. Diagnosis tersebut diperkuat dengan pemeriksaan urobilin dalam tinja dan urin dengan hasil negatif. (6:1)
b. Bilirubin tak terkonjugasi/ indirek
Bilirubin tak terkonjugasi (hematobilirubin) merupakan bilirubin bebas yang terikat albumin, bilirubin yang sukar larut dalam air sehingga untuk memudahkan bereaksi dalam pemeriksaan harus lebih dulu dicampur dengan alkohol, kafein atau pelarut lain sebelum dapat bereaksi, karena itu dinamakan bilirubin indirek. Peningkatan kadar bilirubin indirek mempunyai arti dalam diagnosis penyakit bilirubinemia karena payah jantung akibat gangguan dari delivery bilirubin ke dalam peredaran darah. Pada keadaan ini disertai dengan tanda-tanda payah jantung, setelah payah jantung diatasi maka kadar bilirubin akan normal kembali dan harus dibedakan dengan chardiac chirrhosis yang tidak selalu disertai bilirubinemia. (6:1)
Peningkatan yang lain terjadi pada bilirubinemia akibat hemolisis atau eritropoesis yang tidak sempurna, biasanya ditandai dari anemi hemolitik yaitu gambaran apusan darah tepi yang abnormal,umur eritrosit yang pendek. (6:1)
Pembentukan urobilin
Bilirubin terkonjugasi yang mencapai ileum terminal dan kolon dihidrolisa oleh enzym bakteri β glukoronidase dan pigmen yang bebas dari glukoronida direduksi oleh bakteri usus menjadi urobilinogen, suatu senyawa tetrapirol tak berwarna.7
Sejumlah urobilinogen diabsorbsi kembali dari usus ke perdarahan portal dan dibawa ke ginjal kemudian dioksidasi menjadi urobilin yang memberi warna kuning pada urine. Sebagian besar urobilinogen berada pada feces akan dioksidasi oleh bakteri usus membentuk sterkobilin yang berwarna kuning kecoklatan. (4:2 )
Pengambilan Bilirubin oleh Hati
Bilirubin hanya sedikit larut dalam plasma dan terikat dengan protein, terutama albumin. Beberapa senyawa seperti antibiotika dan obat-obatan bersaing dengan bilirubin untuk mengadakan ikatan dengan albumin. Sehingga, dapat mempunyai pengaruh klinis. Dalam hati, bilirubin dilepaskan dari albumin dan diambil pada permukaan sinusoid dari hepatosit melalui suatu sistem transport berfasilitas (carrier-mediated saturable system) yang saturasinya sangat besar. Sehingga, dalam keadaan patologis pun transport tersebut tidak dipengaruhi. Kemungkinan pada tahap ini bukan merupakan proses rate limiting 9(8)
Konjugasi Bilirubin
Dalam hati, bilirubin mengalami konjugsi menjadi bentuk yang lebih polar sehingga lebih mudah diekskresi ke dalam empedu dengan penambahan 2 molekul asam glukoronat. Proses ini dikatalisis oleh enzim diglukoronil transferase dan menghasilkan bilirubin diglukoronida. Enzim tersebut terutama terletak dalam retikulum endoplasma halus dan menggunakan UDP-asam glukoronat sebagai donor glukoronil. Aktivitas UDP-glukoronil transferase dapat diinduksi oleh sejumlah obat misalnya fenobarbital.(5:8)
Ekskresi bilirubin kedalam empedu
Bilirubin yang sudah terkonjugasi akan disekresi kedalam empedu melalui mekanisme pangangkutan yang aktif dan mungkin bertindak sebagai rate limiting enzyme metabolisme bilirubin. Sekeresi bilirubin juga dapat diinduksi dengan obat-obatan yang dapat menginduksi konjugasi bilirubin. Sistem konjugasi dan sekresi bilirubin berlaku sebagai unit fungsional yang terkoordinasi.9 (8)
Metabolisme Bilirubin di Usus
Setelah mencapai ileum terminalis dan usus besar bilirubin terkonjugasi akan dilepaskan glukoronidanya oleh enzim bakteri yang spesifik (b-glukoronidase). Dengan bantuan flora usus bilirubin selanjutnya dirubah menjadi urobilinogen.9 (8)
Urobilinogen tidak berwarna, sebagian kecil akan diabsorpsi dan diekskresikan kembali lewat hati, mengalami siklus urobilinogen enterohepatik. Sebagian besar urobilinogen dirubah oleh flora normal colon menjadi urobilin atau sterkobilin yang berwarna kuning dan diekskresikan melalui feces. Warna feces yang berubah menjaadi lebih gelap ketika dibiarkan udara disebabkan oksidasi urobilinogen yang tersisa menjadi urobilin.(5:8)
Metabolisme pigmen empedu
Eritrosit pada akhir masa hidupnya (yang sudah terlalu rapuh dalam sirkulasi) membran selnya pecah dan hemoglobin yang lepas difagositosis oleh RES. Hemoglobin dipecah menjadi heme dan globin dan cincin heme dibuka untuk memberikan (1) besi bebas yang ditranspor ke dalam darah oleh transferin, dan (2) rantai lurus dari empat inti pirol, yaitu substrat yang akan dibentuk menjadi pigmen empedu. Pertama pembentukan biliverdin berantai lurus. Biliverdin di konversikan ke bilirubin dengan reduksi. Bilirubin (bebas) yang bersirkulasi dalam plasma terikat albumin (karena bilirubin ini larut lemak). Memasuki hati, albumin melepaskan ikatan dengan bilirubin, dan memasuki hepatosit. Sekitar 80% Bilirubin dikonjugasi oleh asam glukuronat melalui mekanisme yang melibatkan biilirubin-UDP glukuronosiltransferase menjadi bilirubin terkonjugasi (larut air), 10% dikonjugasi dengan sulfat membentuk bilirubin sulfat, dan 10% lainnya berikatan dengan zat lain. Hati orang dewasa mempunyai kapasitas cadangan untuk mengkonjugasi dan mengekskresi 5-10 kali biilrubin normal (500 µmol/24 jam). Pada neonatus, enzim ini belum aktif sepenuhnya, misal aktivitas glukuronosil transferase perlu waktu ±3 minggu untuk berkembang, sehingga hati neonatus hampir tak mempunyai kapasitas untuk mengekskresi beban bilirubin normalnya dan bisa meningkat saat terjadi pemecahan eritrosit berlebih. Ikterus sebelum usia 24 jam adalah abnormal, tapi hiperbilirubinemia moderat (80 µmol/L) dalam minggu pertama mungkin tak patologis (ikterus fisiologis) (2:212)
Ikterus adalah pewarnaan jaringan tubuh menjadi kekuning-kuningan pada kulit dan jaringan dalam. Penyebab umumnya karena sejumlah besar bilirubin masuk dalam cairan ekstrasel, baik bilirubin bebas atau bilirubin terkonjugasi. Konsentrasi bilirubin normal (baik bilirubin bebas dan terkonjugasi) ±0.5 mg/dL plasma. Kulit mulai tampak kuning ketika konsentrasinya meningkat >3 kali dari normal (>1.5 mg/dL)(2:216)
Ekskresi Pigmen Empedu
Empedu yang dihasilkan oleh hepatosit mengalir ke kanalikuli biliaris dan masuk ke duktus biliaris hingga sampai ke usus. Dalam usus besar ia direduksi oleh kerja bakteri menjadi berbagai pigmen termasuk urobilinogen yang mudah larut dan akhirnya menjadi sterkobilinogen. Kemudian sterkobilinogen diekskresikan dalam feses dan mengalami oksidasi dengan udara menjadi sterkobilin. (2:213)
Di usus besar, sebagian besar urobilinogen direabsorbsi mukosa usus kembali ke dalam darah. Sebagian lagi di ekskresikan oleh hati ke usus, tapi ±5% oleh ginjal lewat urin. Setelah terpapar udara, mengalami oksidasi menjadi urobilin.(2:213)
D. Penyakit yang berhubungan dengan bilirubin
Hiperbilirubinemia Hiperbilirubinemia adalah keadaan dimana konsentrasi bilirubin darah melebihi 1 mg/dl. Pada konsentrasi lebih dari 2 mg/dl, hiperbilirubinemia akan menyebabkan gejala ikterik atau jaundice. Ikterik atau jaundice adalah keadaan dimana jaringan terutama kulit dan sklera mata menjadi kuning akibat deposisi bilirubin yang berdiffusi dari konsentrasinya yang tinggi didalam darah. Hiperbilirubinemi Dikelompokkan dala Dua bentuk (5 :7)
Berdasarkan penyebabnya yaitu hiperbilirubinemia retensi yang disebabkan oleh produksi yang berlebih dan hiperbilirubinemia regurgitasi yang disebabkan refluks bilirubin kedalam darah karena adanya obstruksi bilier. Hiperbilirubinemia retensi dapat terjadi pada kasus-kasus haemolisis berat dan gangguan konjugasi. Hati mempunyai kapasitas mengkonjugasikan dan mengekskresikan lebih dari 3000 mg bilirubin perharinya sedangkan produksi normal bilirubin hanya 300 mg perhari. Hal ini menunjukkan kapasitas hati yang sangat besar dimana bila pemecahan heme meningkat, hati masih akan mampu meningkatkan konjugasi dan ekskresi bilirubin larut. Akan tetapi lisisnya eritrosit secara massive misalnya pada kasus sickle cell anemia ataupun malaria akan menyebabkan produksi bilirubin lebih cepat dari kemampuan hati mengkonjugasinya sehingga akan terdapat peningkatan bilirubin tak larut didalam darah. Peninggian kadar bilirubin tak larut dalam darah tidak terdeteksi didalam urine sehingga disebut juga dengan ikterik acholuria. Pada neonatus terutama yang lahir premature peningkatan bilirubin tak larut terjadi biasanya fisiologis dan sementara, dikarenakan haemolisis cepat dalam proses penggantian hemoglobin fetal ke hemoglobin dewasa dan juga oleh karena hepar belum matur, dimana aktivitas glukoronosiltransferase masih rendah. (5:7)
Apabila peningkatan bilirubin tak larut ini melampaui kemampuan albumin mengikat kuat, bilirubin akan berdiffusi ke basal ganglia pada otak dan menyebabkan ensephalopaty toksik yang disebut sebagai kern ikterus. Beberapa kelainan penyebab hiperbilirubinemia retensi diantaranya seperti Syndroma Crigler Najjar I yang merupakan gangguan konjugasi karena glukoronil transferase tidak aktif, diturunkan secara autosomal resesif, merupakan kasus yang jarang, dimana didapati konsentrasi bilirubin mencapai lebih dari 20 mg/dl. Syndroma Crigler Najjar II, merupakan kasus yang lebih ringan dari tipe I, karena kerusakan pada isoform glukoronil transferase II, didapati bilirubin monoglukoronida terdapat dalam getah empedu. Syndroma Gilbert, terjadi karena haemolisis bersama dengan penurunan uptake bilirubin oleh hepatosit dan penurunan aktivitas enzym konjugasi dan diturunkan secara autosomal dominan. Hiperbilirubinemia regurgitasi paling sering terjadi karena terdapatnya obstruksi pada saluran empedu, misalnya karena tumor, batu, proses peradangan dan sikatrik. Sumbatan pada duktus hepatikus dan duktus koledokus akan menghalangi masuknya bilirubin keusus dan peninggian konsentrasinya pada hati menyebabkan refluks bilirubin larut ke vena hepatika dan pembuluh limfe.(5:7)
Bentuknya yang larut menyebabkan bilirubin ini dapat terdeteksi dalam urine dan disebut sebagai ikterik choluria. Karena terjadinya akibat sumbatan pada saluran empedu disebut juga sebagai ikterus kolestatik. Bilirubin terkonjugasi dapat terikat secara kovalen pada albumin dan membentuk θ bilirubin yang memiliki waktu paruh (T1/2) yang panjang mengakibatkan gejala ikterik dapat berlangsung lebih lama dan masih dijumpai pada masa pemulihan.
E. Metode Pemeriksaan Bilirubin Total
Dalam pemeriksaan bilirubin total metode yang dipakai antara lain:
1. Metode Jendrasik- Grof
Prinsip : Bilirubin bereaksi dengan DSA ( diazotized sulphanilic acid) dan membentuk senyawa azo yang berwarna merah. Daya serap warna dari senyawa ini dapat langsung dilakukan terhadap sampel bilirubin pada panjang gelombang 546 nm. Bilirubin glukuronida yang larut dalam air dapat langsung bereaksi dengan DSA, namun bilirubin yang terdapat di albumin yaitu bilirubin terkonjugasi hanya dapat bereaksi jika ada akselerator. Total bilirubin bilirubin direk + bilirubin indirek.(5:9)
2. Colorimetric Test - Dichloroaniline (DCA)
Prinsip :Total bilirubin direaksikan dengan dichloroanilin terdiazotisasi membentuk senyawa azo yang berwarna merah dalam larutan asam, campuran khusus (detergen enables ) sangat sesuai untuk menentukan bilirubin total. Reaksi : Bilirubin + ion diazonium membentuk Azobilirubin dalam suasana asam (Dialine Diagnostik ). (5:9)
F. Faktor - Faktor Yang Mempengaruhi Stabilitas Bilirubin Total
Dalam suatu pemeriksaan bilirubin total, sampel akan selalu berbubungan langsung dengan faktor luar. Hal ini erat sekali terhadap kestabilan kadar sampel yang akan diperiksa, sehingga dalam pemeriksaan tersebut harus memperhatikan faktor-faktor yang mempengaruhi stabilitas kadar bilirubin total dalam serum diantaranya yaitu
a. Sinar
Stabilitas bilirubin dalam serum pada suhu kamar tidak stabil dan mudah terjadi kerusakan terutama oleh sinar, baik sinar lampu ataupun sinar matahari. Serum atau plasma heparin boleh digunakan, hindari sampel yang hemolisis dan sinar matahari langsung. Sinar matahari langsung dapat menyebabkan penurunan kadar bilirubin serum sampai 50% dalam satu jam, dan pengukuran bilirubin total hendaknya dikerjakan dalam waktu dua hingga tiga jam setelah pengumpulan darah. Bila dilakukan penyimpanan serum hendaknya disimpan di tempat yang gelap, dan tabung atau botol yang berisi serum di bungkus dengan kertas hitam atau aluminium foil untuk menjaga stabilitas serum dan disimpan pada suhu yang rendah atau lemari pendingin (5:6)
b. Suhu Penyimpanan
Suhu merupakan faktor luar yang selalu berhubungan langsung terhadap sampel, baik saat penyimpanan maupun saat pemeriksaan. Pemeriksaan kadar bilirubin total sebaiknya diperiksa segera, tapi dalam keaadaan tertentu pemeriksaan kadar bilirubin total bisa dilakukan penyimpanan. Dengan penyimpanan yang benar stabilitas serum masih stabil dalam waktu satu hari bila disimpan pada suhu 15 ºC-25ºC, empat hari pada suhu 2ºC-8ºC, dan tiga bulan pada penyimpanan -20ºC . (DialineDiagnostik ). Lamanya sampel kontak dengan faktor-faktor di atas berpengaruh terhadap kadar bilirubin didalam sampel sehingga perlu upaya mengurangi pengaruh tersebut serta mengoptimalkan kadar bilirubin total di dalam serum agar dapat bereaksi dengan zat pereaksi secara sempurna, sedangkan reagen bilirubin total akan tetap stabil berada pada suhu 2-8ºC dalam keadaan tertutup, terhindar dari kontaminan dan sinar. Dalam hal ini dapat dimungkinkan bahwa penurunan kadar bilirubin dipengaruhi oleh kenaikan suhu dan pengaruh sinar yang berintensitas tinggi .(5:7)
c. Kesalahan-kasalahan Dalam Pemeriksaan Laboratorium
1. Kesalahan Kasar
Merupakan kesalahan yang dapat timbul akibat kekeliruan pada penanganan sampel, pipetasasi, reagensia, panjang gelombang dan lain lain. Hasil yang diukur biasanya tidak sesuai yang diharapkan maka kesalahan yang demikian dapat segera diketahui. (5:8)
2. Kesalahan Acak
Pengukuran suatu zat pada kondisi yang sama untuk beberapa kali pada suatu sampel, kita mendapatkan hasil yang tidak sama, hasil-hasil yang didapat pasti berdeviasi satu sama lain. Hasil nilai yang didapat pada kesalahan acak tidak dapat dihindari tapi bisa diatasi dengan melakukan pemeriksaan yang cermat dan teliti serta reagensia dan peralalatan yang baik.(5:8)
3. Kesalahan Sistemik atau Sistematik
Biasanya disebabkan oleh pipet yang kurang akurat, penyimpanan serum yang kurang baik, suhu yang tidak sesuai waktu pemeriksaan, reagensia yang rusak dan photometer yang tidak terkalibrasi. (5:8)
II.2 Uraian Bahan
1. Alkohol ( 7 : 63 )
Nama lain : Aethanolum
Berat Molekul : 46,07
Rumus Molekul : C2H5OH
Berat Jenis : Antara 0.812 dan 0.816
Pemerian : Cairan mudah menguap , jernih, tidak berwarna. Bau khas dan menyebabkan rasa terbakar pada lidah, mudah menguap walaupun pada suhu rendah dan mendidih pada suhu 78o, mudah terbakar.
Kelarutan : Bercampur dengan air dan praktis bercampur dengan semua pelarut organik.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat, jauh dari api.
BAB III
METODE PERCOBAAN
III.1 Alat Dan Bahan
III.1.1 Alat
Alat yang digunakan dalam percoban ini adalah Sentrifuge, cuvet, humalyzer, mikropipet ( 1000 µl, dan 100 µl ) rak tabung, stopwatch, torniquet, tabung sentrifuge, dan tip (yellow dan blue tip).
III.1.2 Bahan
Bahan yang digunakan pada percobaan ini yaitu serum, kapas alkohol dan spoit ( 3 cc / 5 cc ), Reagen bilirubin total (Asam sulfanilic, Asam Hydroclorit, Caffeine, Natrium benzoat), Reagen T-Nitrit (Natrium Nitrit), Reagen Bilirubin Direct ( asam sulfanilic, Asam hydroklorit), reagen D-Nitrit (Natrium Nitrit).
III. 2 Cara Kerja
a. Pengambilan darah Vena
1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
2. Tourniquet dipasang pada lengan atas probandus
3. Kulit bagian lengan ditegakkan dengan jari tangan kiri agar vena tidak bergerak pada saat tusukkan spoit.
4. Bagian yang akan diambil didesinfeksi dengan kapas alcohol 70%
5. Spoit ditusuk ke dalam lumen vena, penghisap spoit ditarik perlahan -lahan sampai jumlah darah yang diinginkan, kemudian tourniquet dilepaskan.
6. Kapas ditaruh diatas jarum dan spoit ditarik perlahan-lahan
7. Jarum spoit dibuka dan darah dialirkan perlahan ke dalam melewati dinding tabung reaksi.
8. Tabung reaksi disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm dalam waktu 15 menit.
b. Pemeriksaan bilirubin total
1 Alat serta bahan yang akan digunakan disiapkan,
2. kemudian dipipet kedalam kuvet reagen bilirubin total sebanyak 1000 µl,
3. Ditambahkan reagen T-Nitrit sebanyak 1 tetes, dihomogenkan dengan baik kemudian diinkubasi selama 5 menit.
4. Kemudian ditambahkan serum (darah yang telah disentrifuge) sebanyak 100 µl dan dimasukkan kedalam kuvet yang berisi reagen
5. Larutan dihomogenkan dengan menggunakan mikropipet dan di inkubasi selama 15 menit menit pada suhu 370c.
6. Kemudian blanko diperiksa terlebih dahulu dan diikuti pembacaan sampel pada alat humalyzer.
c. Pemeriksaan Bilirubin Direct
1. Alat serta bahan yang akan digunakan disiapkan,
2. Dipipet ke dalam kuvet reagen bilirubin direct sebanyak 1000 µl,
3. Ditambahkan reagen D-Nitrit sebanyak 1 tetes, dihomogenkan dengan baik
4. Ditambahkan serum dalam 2 menit sebanyak 100 µl dan dimasukkan kedalam kuvet yang berisi reagen.
5. Larutan dihomogenkan dengan menggunakan mikropipet kemudian di inkubasi selama 5 menit tepat pada suhu 370c
6. Kemudian blanko diperiksa terlebih dahulu dan diikuti pembacaan sampel pada alat humalyzer
BAB IV
HASIL PENGAMATAN
IV.1 Tabel Pengamatan
| Kelompok | Bilirubin Total | Bilirubin Direct | Bilirubin Indirect |
| 1 | 0.3 | 0.4 | -0.1 |
| 2 | 0.4 | 0.4 | 0 |
| 3 | 0.2 | 0.4 | - 0.2 |
| 4 | 0.1 | 0.3 | -0.2 |
| 5 | 0.3 | 0.8 | -0.5 |
| 6 | 0.7 | 0.1 | 0.6 |
| 7 | 0.3 | 0.3 | 0 |
b. Nilai Normal
| Bilirubin Total | Mg/dl | µmol/l |
| Pada Kelahiran, Sampai | 5 | 85.5 |
| 5 Hari, sampai | 12 | 205.0 |
| 1 Bulan , sampai | 1.5 | 25.6 |
| Dewasa, sampai | 1.1 | 18.8 |
| Bilirubin direct | ||
| Dewasa, Sampai | 0.25 | 4.3 |
IV.2 Gambar
| Laboratorium Kimia Farmasi Universitas Hasanuddin |
 |
| Setelah Disentrifuge |
| Laboratorium Kimia Farmasi Universitas Hasanuddin |
 |
| Sampel Serum |
| Laboratorium Kimia Farmasi Universitas Hasanuddin |
 |
| Humalyzer |
| Laboratorium Kimia Farmasi Universitas Hasanuddin |
 |
| Reagen Bilirubin Total |
| Laboratorium Kimia Farmasi Universitas Hasanuddin |
 |
| Reagen Bilirubin Direct |
IV. 3 PERHITUNGAN
Diketahui : Bilirubin total (BT) = 0.3
Bilirubin direct (BD) = 0.3
Ditanyakan : bilirubin indirect (BI) ..........?
Penyelesaian : rumus BT = BD + BI
BI = BT – BD
BI = 0.4 – 0.3
= 0 mg/dl
Jadi, bilirubin indireknya adalah 0 mg/dl
IV. 4 Reaksi
Asam sulfanilic + Natrium nitrit DSA
Blilirubin + DSA DIRECT azobilirubin
Blilirubin + DSA + accelerator TOTAL AzobilirubinBAB V
PEMBAHASAN
Pengukuran kadar bilirubin serum merupakan prosedur yang relatif sederhana dilakukan di laboratorium, dan sering digunakan sebagai indikator yang peka untuk fungsi hati. Bilirubin terbagi atas dua komponen yaitu, bilirubin terkonjugasi ( bilirubin direk ) dan yang tak terkonjugasi (bilirubin indirek). Pada praktikum, dilakukan pemeriksaan fungsi hati bilirubin total dan direk yang masing – masingnya menggunakan sampel serum yang diperiksa secara fotometrik menggunakan humalyzer dengan reagen kit , yaitu untuk pemeriksaan bilirubin total yang terdiri dari larutan reagen bilirubin total dan reagen T-Nitrit sedangkan pemeriksaan bilirubun direk dengan larutan reagen direk dan reagen D-Nitrit sedangkan untuk pemeriksaan bilirubin indirek tidak dilakukan tetapi dihitung sebagai perbedaan antara bilirubin total dan fraksi direk
Pemeriksaan Bilirubin Total
Pada pemeriksaan bilirubin total dilakukan dengan pengambilan sampel darah dengan teknik flebotomi Yang perlu diperhatikan pada saat pengambilan darah untuk sampel Bilirubin total adalah menghindari terjadinya hemolisis pada eritrosit,, lipemia atau pajanan sumber cahaya yang dapat menurunkan konsentrasi bilirubin serum yang. kemudian dilakukan sentrifugasi yang berguna untuk mengendapakan analit tertentu, menempatkan partikel dan medium suspensinya dalam suatu medan gaya sentrifugasi. Medan sentrifugasi menyebabkan partikel bermigrasi lebih cepat ke arah luar dari sumbu rotasi sehingga terjadi pemisahan sedimen dan suspensinya yang dilakukan selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm guna memperoleh serum yang akan digunakan sebagai sampel pemeriksaan. sampel tersebut diperiksa dengan melakukan penambahan reagen bilirubin total sebanyak 1000 µI dan 1 tetes larutan T- Nitrit, fungsi penambahan reagen ini adalah sebagai akselerator guna mempercepat reaksi dengan membentuk zat warna azo. Kemudian reagen tersebut diinkubasi selama 5 menit berguna untuk mempercepat reaksi dimana analit-analit pada sampel akan berikatan dengan sampel sehingga terjadi reaksi yang sempurna.setelah itu dilakukan penambahan sampel sebanyak 100 µI dan dilakukan inkubasi selama 15 menit setelah itu diperiksa terlebih dahulu blanko yang berguna sebagai standar dimana hal ini digunakan sebagai pembanding. Lalu diperiksa secara fotometrik pada humalyzer, dengan prinsip reaksinya yaitu terjadi dimana asam sulphanilic direaksiakan dengan natrium nitrit menjadi diazotised sulphanilic acid (DSA) yang akan bereaksi dengan bilirubin dan accelator membentuk zat warna azo. sehingga hasil yang diperoleh pada pameriksaan bilirubin total adalah 0,3 mg/dl Hasil yang diperoleh yaitu normal karena berada pada range normal untuk orang dewasa yaitu 1,1 mg/dl yang dapat diinterpretasikan hasilnya tidak terjadi gangguan pada hati.
Faktor yang dapat mempengaruhi temuan laboratorium :
a. Sampel hemolisis,
b. Pengaruh obat-obatan tertentu seperti antibiotic, obat antipiretik seperti Paracetamol dan vitamin
c. Sampel yang diperiksa terlalu lama dan tidak dibekukan.
Pemeriksaan bilirubin direct
Bilirubin terkonjugasi (bilirubin glukoronida atau hepatobilirubin) masuk ke saluran empedu dan diekskresikan ke usus. Selanjutnya flora usus akan mengubahnya menjadi urobilinogen dan dibuang melalui feses serta sebagian kecil melalui urin. Bilirubin terkonjugasi bereaksi cepat dengan asam sulfanilat yang terdiazotasi membentuk azobilirubin (reaksi van den Bergh), karena itu sering dinamakan bilirubin direk atau bilirubin langsung.
Dalam pemeriksaan bilirubin direk, dilakukan dengan pengambilan sampel darah dengan teknik flebotomi Yang perlu diperhatikan pada saat pengambilan darah untuk sampel Bilirubin direk adalah menghindari terjadinya hemolisis pada eritrosit,, lipemia atau pajanan sumber cahaya yang dapat menurunkan konsentrasi bilirubin serum yang. kemudian dilakukan sentrifugasi yang berguna untuk mengendapakan analit tertentu, menempatkan partikel dan medium suspensinya dalam suatu medan gaya sentrifugasi. Medan sentrifugasi menyebabkan partikel bermigrasi lebih cepat ke arah luar dari sumbu rotasi sehingga terjadi pemisahan sedimen dan suspensinya yang dilakukan selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm guna memperoleh serum yang akan digunakan sebagai sampel pemeriksaan.
sampel tersebut diperiksa dengan melakukan penambahan reagen bilirubin total sebanyak 1000 µI dan 1 tetes larutan D- Nitrit, fungsi penambahan reagen ini adalah sebagai akselerator guna mempercepat reaksi dengan membentuk zat warna azo. Kemudian reagen tersebut ditambahkan sampel sebanyak 100 µI dan dilakukan inkubasi selama 15 menit setelah itu diperiksa terlebih dahulu blanko yang berguna sebagai standar dimana hal ini digunakan sebagai pembanding. Lalu diperiksa secara fotometrik pada humalyzer, dengan prinsip reaksinya yaitu terjadi dimana asam sulphanilic direaksiakan dengan natrium nitrit menjadi diazotised sulphanilic acid (DSA) yang akan bereaksi dengan bilirubin dan akselerator berupa senyawa caffein yang berada didalam komposisi reagen sehingga membentuk zat warna azo.
Dari praktikum hasil yang diperoleh pada pemeriksaan bilirubin direk adalah 0,3 mg/dl Hasil yang diperoleh yaitu tidak normal dimana hasilnya tidak berada pada range normal untuk orang dewasa yaitu 0,25 mg/dl yang dapat diinterpretasikan hasilnya terjadi gangguan pada hati.sednagkan bilirubin indirek tidak diukur secara langsung tetapi . bilirubin indirek diperhitungkan dari selisih antara bilirubin total dan bilirubin direk hal ini disebabkan karena bilirubin total melibatkan pelarutan bentuk tidak terkonjugasi sebelum kuantifikasi kimiawi.dengan demikian hasil yang diperoleh untuk bilirubin indirek adalah hasil kurang antara bilirubin total dan bilirubin direk sehingga hasilnya adalah (0,3 mg/dl – 0,3 mg/dl) = 0 mg/dl sehingga diinterpretasikan terjadi gangguan fungsi hati,dengan melihat range nilai normal bilirubin indirect adlah 0.1-1.0 mg/dl. Adapun hal-hal yang dapat menyebabkan peningkatan dan penurunan kadar bilirubin total dan bilirubin direct adalah sebagai berikut:
a. PENINGKATAN KADAR bilirubin direk dan total : menunjukkan adanya gangguan pada hati (kerusakan sel hati) atau saluran empedu (batu atau tumor). Bilirubin terkonjugasi tidak dapat keluar dari empedu menuju usus sehingga akan masuk kembali dan terabsorbsi ke dalam aliran darah. Sehingga masalah klinis yang muncul pada bilirubin direk dan total adalah ikterik obstruktif karena batu atau neoplasma, hepatitis, sirosis hati, mononucleosis infeksiosa, metastasis (kanker) hati, penyakit Wilson. Pengaruh obat : antibiotik (amfoterisin B, klindamisin, eritromisin, gentamisin, linkomisin, oksasilin, tetrasiklin), sulfonamide, obat antituberkulosis ( asam para-aminosalisilat, isoniazid), alopurinol, diuretic (asetazolamid, asam etakrinat), mitramisin, dekstran, diazepam (valium), barbiturate, narkotik (kodein, morfin, meperidin), flurazepam, indometasin, metotreksat, metildopa, papaverin, prokainamid, steroid, kontrasepsi oral, tolbutamid, vitamin A, C, K.
b. PENURUNAN KADAR : anemia defisiensi besi. Pengaruh obat : barbiturate, salisilat (aspirin), penisilin, kafein dalam dosis tinggi.
Hal-hal yang dapat menyebabkan peningkatan dan penurunan kadar bilirubin indirect adalah sebagai berikut:
a. PENINGKATAN KADAR : eritroblastosis fetalis, anemia sel sabit, reaksi transfuse, malaria, anemia pernisiosa, septicemia, anemia hemolitik, talasemia, CHF, sirosis terdekompensasi, hepatitis. Pengaruh obat : aspirin, rifampin, fenotiazin (lihat biliribin total, direk)
b. PENURUNAN KADAR : pengaruh obat barbiturate, salisilat (aspirin), penisilin, kafein dalam dosis tinggi.
Faktor yang dapat mempengaruhi temuan laboratorium :
a. Makan malam yang mengandung tinggi lemak sebelum pemeriksaan dapat mempengaruhi kadar bilirubin.
b. Wortel dan ubi jalar dapat meningkatkan kadar bilirubin.
c. Hemolisis pada sampel darah dapat mempengaruhi hasil pemeriksaan.
d. Sampel darah yang terpapar sinar matahari atau terang lampu, kandungan pigmen empedunya akan menurun.
e. Obat-obatan tertentu dapat meningkatkan atau menurunkan kadar bilirubin.
Faktor-faktor kesalahan yang dapat terjadi pada saat praktikum
a. Terjadi lisis pada sampel dan Waktu inkubasi sampel tidak sesuai
b. Volume sampel / reagen (buffer dan substrat) tidak sebanding
c. Cuvet yang digunakan terkontaminasi dengan zat lain sehingga reaksi yang terjadi tidak sempurna
d. Sampel terkena cahaya, sehingga kadar bilirubinnya menurun
BAB VI
PENUTUP
VI.1 kesimpulan
Dari hasil praktikum diperoleh hasil yaitu :
a. Pemeriksaan bilirubin total hasilnya yaitu 0.3 mg/dl sehingga diinterpretasikan hasilnya normal
b. Pemeriksaan bilirubin direct 0.3 mg/dl sehingga diinterpretasikan hasilnya tidak normal dimana
c. Indirek hasilnya yaitu 0 mg/dl sehingga diinterpretasikan hasilnya tidak normal
VI.2 Saran
Diharapkan alat-alat laboratorium di lengkapi lagi guna memperlancar proses praktikum.
DAFTAR PUSTAKA
1. Sudoyo, A.W. Dkk ; 2007 ; Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam Jilid I ed.IV Pusat Penerbitan Departemen Ilmu Penyakit Dalam Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia ; Jakarta
2. Baron . D. N ; 1981 ; kapita selekta patologi klinik ; penerbit buku kedokteran (EGC) ; Jakarta
3. Sacher A. Ronald dan Richard A. McPherson ; 2004; tinjauan klinis hasil pemeriksaan laboratorium ; penerbit buku Kedokteran (EGC) ; Jakarta
5. Helvi Mardiani; 2004; Metabolisme HEME ;Digital Library;.Universitas Sumatera Utara ; Medan pdF diakses tanggal 20 maret 2011
6. Riswanto ; 2009 Tes kimia darah laboratorium kesehatan ; diakses tanggal 4 maret 2011
7. Dirjen POM ; 1979 ; Farmakope Indonesia edisi III ;Departemen kesehatan RI ; Jakarta
Skema Kerja
a. Bilirubin Direct
Reagen bilirubin direct ( 1000 µl )
+ D-Nitrit ( 1 tetes )Masukkan dalam kuvet
Pipet sampel ( 100 µl )
dalam 2 menit
Inkubasi 5 menit ( suhu 370C )Baca di humalyzer
b. Bilirubin Total
Reagen bilirubin total ( 1000 µl )
+ T-Nitrit ( 1 tetes )
Masukkan dalam kuvetInkubasi 5 menit ( suhu 370C )
Pipet sampel ( 100 µl )Inkubasi 15 menit ( suhu 370C )
 |
Baca di humalyzer
Komposisi Reagen
a. Pemeriksaan Bilirubin Direct
1. 1 x 100 ml reagen bilirubin direct ( tutup biru )
Asam sulfanilic 14 mmol/l
Asam hydroclorit 250 mmol/l
2. 1 x 9 ml reagen D-Nitrit ( tutup biru )
Natrium Nitrit 0,9 mmol/l
b. Pemeriksaan Bilirubin total
1. 1 x 100 ml reagen bilirubin total ( tutup putih )
Asam sulfanilic 14 mmol/l
Asam hydroclorit 250 mmol/l
Caffeine (accelerator) 200 mmol/I
Natrium benzoate 420 mmol/I
2. 1 x 9 ml reagen D-Nitrit (tutup putih)
Untuk pengukuran bilirubin direct
Natrium nitrit 0,9 mmol/I
1. Asam Sulfanilat ( 7 : 653 )
Nama resmi : Asam sulfanilat
Nama lain : Asam sulfanilat
RM : C6H7NO3S
Pemerian : Hablur atau serbuk; putih atau hampir putih
Kelarutan : Larut dalam 33 bagian air panas, terjadi larutan jernih tidak berwarna, jika ingin menghablur.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik
Kegunaan : Sebagai pereaksi
2. Caffeine ( 7 : 175 )
Nama resmi : Coffeinum
Nama lain : Kofeina
RM/BM : C8H10N4O2/ 194,19
Pemerian : Serbuk atau hablur bentuk jarum mengkilat biasanya menggumpal; putih; tidak berbau; rasa pahit.
Kelarutan : Agak sukar larut dalam air dan dalam etanol (95%) P; mudah larut dalam kloroform P; sukar larut dalam eter P.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik
Kegunaan : Stimulan syaraf pusat, kardiotonikum
3. Natrium benzoate ( 7 : 395 )
Nama resmi : Natrii Benzoas
Nama lain : Natrium benzoat
RM/BM : C7H5NaO2/ 144,11
Pemerian : Butiran atau serbuk hablur; putih; tidak berbau atau hampir tidak berbau.
Kelarutan : Larut dalam 2 bagian air dan dalam 90 bagian etanol (95%) P.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik
Kegunaan : Sebagai zat pengawet
- Natrium nitrit ( 7 : 714 )
Nama resmi : Natrium Nitrit
Nama lain : Natrium Nitrit
RM : NaNO2
Pemerian : Hablur atau granul, tidak berwarna atau putih atau kekuningan; merapuh.
Kelarutan : Larut dalam 1,5 bagian air, agak sukar larut dalam etanol (95%) P.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat dan baik
Kegunaan : Sebagai pereaksi
